Winzigstes sichtbar gemacht

Mit Farbstoffen gegen das Dogma

2014 ging der Nobelpreis für Chemie an Stefan Hell. Der deutsche Physiker erhielt die Auszeichnung – zusammen mit den beiden Amerikanern Eric Betzig und William Moerner – für die Entwicklung der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie. Hell war es 1999 gelungen, das über 100 Jahre lang geltende Dogma der begrenzten Auflösung in der Lichtmikroskopie zu stürzen. Das gelang ihm durch eine geniale Idee, für deren Umsetzung er Fluoreszenzfarbstoffe benutzte. Sie werden in der Mikroskopie von Zellen ohnehin verwendet, etwa um zu erfahren, wo sich bestimmte Zellen aufhalten.

Das Entscheidende bei Stefan Hells spezieller Form der Fluoreszenzmikroskopie, der stimulierten Emissionslöschung (stimulated emission depletion, STED): Die Farbstoff-Moleküle leuchten nur im Brennpunkt eines Laserstrahls. In einem ringförmigen Bereich um den Brennpunkt herum sorgt ein zweiter Laser dafür, dass dort die Fluoreszenz-Moleküle abgeschaltet werden. Damit fluoreszieren die Moleküle nur im Zentrum des Leuchtflecks, außerhalb davon ist es dunkel. Wenn der STED-Laserstrahl über die Probe geführt wird, lassen sich dicht beieinander liegende Punkte getrennt beobachten. Das Gesamtbild aus den einzelnen Aufnahmen erscheint dadurch viel schärfer, als es das Abbe-Limit erlaubt hätte.

Die Mit-Nobelpreisträger Eric Betzig und William Moerner erzielten den gleichen Effekt, indem sie verschiedene Fluoreszenz-Moleküle durch Licht unterschiedlicher Wellenlänge anregten. Diese angeregten Moleküle können weit voneinander entfernt liegen – erst ein Computerprogramm erzeugt ein Bild des Objekts. Die beiden US-Amerikaner gaben ihrer Methode den Namen PALM/STORM („Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie, kombiniert mit stochastischer optischer Rekonstruktions-Mikroskopie“).

Ein Nanometer im Visier

Die Innovationen der drei Forscher lösten rasch weitere Entwicklungen aus. Mikroskophersteller erreichten mit ihren Geräten bald räumliche Auflösungen von 20 bis 30 Nanometern, also rund ein Zehntel der Abbe-Grenze, dazu Folgen von bis zu mehreren Dutzend Bildern pro Sekunde. Eine nochmals 20-fach höhere Auflösung scheint mit dieser Technik möglich zu sein. Die natürliche Grenze ist die Größe der Farbstoff-Moleküle. Sie bestehen aus 20 bis 30 Atomen, die zusammen rund einen Nanometer groß sind.

Für Anwendungen kooperierten die Max-Planck-Forscher um Stefan Hell unter anderem mit Virologen der Universität Heidelberg, die Aids auslösende HI-Viren mit Fluoreszenz-Molekülen markieren. So können sie exakt verfolgen, wie die Viren in Zellen eindringen. Einblicke in die Prozesse, wie HI-Viren Zellen infizieren, sollen helfen, neue Angriffspunkte für eine dauerhafte Aids-Therapie zu identifizieren.

In einem anderen Projekt analysierten Stefan Hell und sein Team gemeinsam mit Wissenschaftlern der schottischen University of Edinburgh 2018 Vorgänge in den Nervenzellen lebender Mäuse. In der Membran an den Verbindungsstellen zweier Nerven, den Synapsen, markierten die Forscher das Strukturprotein PSD95. Das Molekül, das in einer Vielzahl von Nervenzellen vorkommt, verfolgten sie per STED-Mikroskop mit besonders schonendem infraroten Laserlicht. Das erlaubt längere Beobachtungen von Molekülen, die dabei kaum beeinträchtigt werden.

Suche nach neuer Parkinson-Therapie

„Die Zelle merkt praktisch nicht, dass wir sie beobachten“, sagt Stefan Hell. Das Licht störe sie kaum, und auch nicht die biologischen Abläufe in der Zelle. Mit höchstauflösender Bildgebung lassen sich so Fehlfunktionen aufdecken, etwa bei der Parkinson-Krankheit, wo in den Zellen Proteine falsch gefaltet werden. „Das kann zu neuen Therapien führen“, meint Hell.

Um eine Trennschärfe von einem Nanometer zu erreichen, trieben mehrere Forschergruppen die „Fluoreszenznanoskopie“ weiter voran. 2016 präsentierten Stefan Hell und sein Team ein verbessertes Fluoreszenzmikroskop, genannt MINFLUX. Es kombiniert die Prinzipien der beiden Nanoskopietechniken mit der besten Auflösung, für die 2014 der Nobelpreis verliehen wurde: STED- und PALM/STORM-Nanoskop.

Beide Mikroskope trennen benachbarte fluoreszierende Moleküle, indem sie diese nacheinander an- und ausschalten. Die STED-Mikroskopie setzt dafür einen ringförmigen Laserstrahl ein, der das Leuchten der Moleküle an festgelegten Koordinaten in der Probe unterdrückt. Dadurch ist die Position des gerade leuchtenden Ausschnitts genau bekannt. Allerdings ist der Ring zu groß für einzelne Moleküle.

Bei PALM/STORM hingegen werden nacheinander Moleküle mit jeweils verschiedenfarbigen Fluoreszenzmarkern angeregt, und die Einzelaufnahmen werden überlagert. Erst die Bildverarbeitung unterläuft die optische Auflösungsgrenze. Im Prinzip sieht man einzelne Moleküle, kennt aber ihre genauen Positionen nicht.

Zwei Techniken vereint

Das auf dieser Grundlage entwickelte MINFLUX-Mikroskop kombiniert die Stärken beider Techniken in einem neuen Konzept: Es schaltet einzelne Moleküle zufällig an und aus. Gleichzeitig bestimmt es deren exakte Position mit einem ringförmigen Laserstrahl.

Das neue MINFLUX-Gerät erreicht eine Trennschärfe von wenigen Nanometern – und ist damit rund 100-mal so scharf wie herkömmliche Lichtmikroskope. Einzelne Proteine lassen sich damit bereits identifizieren, wenn sie nur sechs Nanometer voneinander entfernt sind. Und selbst Moleküle, die sich sehr schnell in der Zelle bewegen, kann man mit dem MINFLUX verfolgen.

2D-Aufnahmen von Molekülen

Max-Planck-Forscher Hell erwartete, dass sich mit der MINFLUX-Mikroskopie Zellen molekular fotografieren lassen. Das hat sich bewahrheitet: Im Juli 2020 präsentierten die Forscher das neue Mikroskop. Und wie das Team um Stefan Hell im Fachblatt „Nature Methods“ berichtete, lassen sich damit „fluoreszierende Moleküle in Zellen mit maximaler molekularer Auflösung, in zwei Farben und dreidimensional sichtbar machen“.

Damit kann das verbesserte Nanoskop Moleküle in lebenden Zellen scharf abbilden und untersuchen, und zwar mit ihren räumlichen Bewegungen in alle Richtungen. Das eröffnet neue Möglichkeiten, um zu erforschen, wie Leben auf molekularer Ebene funktioniert – etwa beim Transport von Viren und Biomolekülen in lebenden Zellen. Das Versprechen der Fluoreszenznanoskopie sei „immens“, stellen Stefan Hell und sein Team in ihrer Publikation fest. Es gebe „aufregende Möglichkeiten“, die Nanoskopie mit anderen Abbildungstechniken zu kombinieren – vor allem mit der Elektronenmikroskopie.

Fundamentale Einblicke ins Leben

Die Mikroskopie per Elektronen gibt es bereits viel länger als die Fluoreszenzmikroskopie. Ingenieure feilen daran schon seit fast einem Jahrhundert und verzichten dabei völlig auf Lichtstrahlen. Die Proben werden statt mit Licht mit Elektronen beschossen. Die lange Entwicklungszeit, die 1931 begann, hat sich gelohnt. Denn mit dieser alternativen Methode konnten Forscher 2020 die ultimative Grenze erreichen, die physikalisch möglich ist: Sie machten einzelne Atome sichtbar. Das eröffnet Einblicke in biologische Fundamentalvorgänge – etwa in das, was Proteine in Zellen anstellen oder wie der Körper zu seinem Fett kommt.

Obwohl sich ihre Ziele ähneln, sind Fluoreszenznanoskopie und Kryo-Elektronenmikroskopie keine direkten Konkurrenten. Das betrifft einmal die räumliche Auflösung. „Im Alltag sind wir immer noch um ein Hundertstel bis ein Tausendstel unter der Fluoreszenznanoskopie“, sagt Holger Stark. Der Biochemiker vom Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen ist einer der Treiber der Kryo-Elektronenmikroskopie-Technik. Er erinnert an Vorwürfe, die sich Ernst Ruska, der Pionier der Elektronenmikroskopie, 1931 anhören musste: Elektronenstrahlen würden feste Proben verbrennen, biologisches Material würde im Vakuum austrocknen, schrumpfen und jede Abbildung würde verzerrt, hieß es damals.

Stabile Spannung, scharfe Bilder

Die Kritiker haben unterschätzt, wozu menschlicher Erfindungsgeist fähig ist. Gleichwohl war es ein weiter Weg, der damals begann und bis in die Gegenwart reicht. In der Frühzeit der Elektronenmikroskopie rangen Elektroingenieure wie Ruska damit, die Hochspannung zu stabilisieren sowie die Elektronenströme konstant zu halten, um stabile und halbwegs scharfe Bilder zu bekommen. Damals war das nur mit einer Kamera möglich.

Seither hat sich die Technik drastisch verändert. Aber die Elektronenmikroskopie beruht nach wie vor auf drei Säulen, erklärt Holger Stark: Mikroskopie, Präparation der Proben und Bildverarbeitung. „Im Ultrahochvakuum kommen alle drei Dinge zusammen. Jedes einzelne kann einem ein Bein stellen.“

Als ab 1970 elektronische CCD-Kameras und seit den 1990er-Jahren auch CMOS-Kameras mit aktiven Pixelsensoren aufkamen, ließen sich Elektronen erstmals direkt detektieren. Zugleich wuchs die Menge an Bilddaten. „Hätte man eines unserer heutigen Elektronenmikroskope vor 20 Jahren gehabt“, sagt Holger Stark, „hätte uns das gar nichts genutzt. Denn es existierten damals noch keine Computer, um solche Unmengen an Bilddaten zu verarbeiten.“

Um hier voranzukommen, musste einer der Kritikpunkte ausgeräumt werden, mit denen schon Ernst Ruska konfrontiert war. Wie lassen sich wasserhaltige biologische Proben ins Hochvakuum einbringen, ohne dass sie dabei austrocknen und kaputtgehen? Es war ein Schweizer Biophysiker, der dieses Problem löste.

Ein eisiger Schock

Ihm half ein Schock – ein Gefrierschock. Jacques Dubochet und seine Kollegen kamen 1981 am European Molecular Biology Laboratory in Heidelberg auf den Trick, die Proben so blitzartig einzufrieren, dass das enthaltene Wasser nicht auskristallisieren konnte. Innerhalb der amorphen Eisschicht, die sich so bildete, blieben die Proben erhalten und waren vor dem Ultrahochvakuum geschützt.

Die Kryo-Elektronenmikroskopie war geboren. 2017 erhielt Dubochet dafür den Nobelpreis für Chemie – gemeinsam mit Joachim Frank, der die Software entwickelte, um unscharfe zweidimensionale Aufnahmen in scharfe dreidimensionale Bilder zu verwandeln. Der Dritte im Bunde war der schottische Molekularbiologe Richard Henderson, dem schon 1990 das erste 3D-Bild eines Proteins mit atomarer Auflösung geglückt war.

Die schärfsten Protein-Bilder

Für Elektronenstrahlen sind die gefrorenen Gewebe fast transparent. Ab jetzt galt „Feuer frei“: Mit Tausenden von Durchleuchtungen desselben Objekts mit Elektronenstrahlen aus verschiedenen Richtungen ließen sich per Bildsoftware 3D-Modelle erzeugen. Im Mai 2020 vermeldeten gleich zwei Forschergruppen den entscheidenden Durchbruch. Holger Stark in Göttingen sowie Sjors Scheres und Radu Aricescu von der Cambridge University mit ihren Teams hatten die schärfsten je gewonnenen Bilder von Proteinen geschossen: atomar genau und mit filmartigen Bildfolgen.

Für atomgenaue Details waren die Biologen davor auf die Methode der Röntgenkristallografie angewiesen. Dabei werden die Biomoleküle zuerst kristallisiert, dann mit Röntgenstrahlen durchleuchtet. Aus den entstandenen Beugungsmustern lässt sich die Struktur der Moleküle ablesen. Doch es dauert oft Monate bis Jahre, um bestimmte Proteine auskristallisieren zu lassen. Und manche medizinisch wichtigen Moleküle kristallisieren überhaupt nicht aus. Bei der Kryo-Elektronenmikroskopie dagegen reicht es, die Proteine in eine gereinigte Lösung zu bringen.

Eingesperrte Eisenmoleküle

Zur Demonstration hatten sich beide Teams das Protein Apoferritin vorgeknöpft, das Eisen-Moleküle in einer Art Käfig speichert. Das Eiweiß gilt als besonders stabil – ideal, um die Künste der Kryo-EM daran auszuprobieren. Die Göttinger Wissenschaftler konnten in dem Protein die Position einzelner Atome mit einer räumlichen Auflösung von 1,2 Angström identifizieren – das sind gerade einmal 0,12 Nanometer. Sie sahen sogar einzelne Wasserstoff-Atome – im Protein selbst und auch in den umgebenden Wasser-Molekülen. „Die direkte Visualisierung der Atompositionen ist wesentlich, um die chemischen Reaktionen zu verstehen, die durch Proteine katalysiert werden“, erklärt Holger Stark.

Wo liegen die Grenzen für die Jäger nach immer besserer Auflösung und Trennschärfe? „Unterhalb von einem Angström ist das mit der Kryo-Elektronenmikroskopie momentan nicht erreichbar“, sagt Stark. Für eine Auflösung von 1,25 Angström sind bereits eine Million Bilder nötig, für ein Angström bräuchte man eine Milliarde – zu viel für heutige Computer. Doch die Göttinger Max-Planck-Forscher suchen trotzdem weiter. Denn durch atomare Vergleichsdaten aus der Röntgenkristallografie wissen sie, dass bestimmte Proteinteile auch bei der jetzigen Kryo-Elektronenmikroskopie verborgen bleiben. „Daher rüsten wir unser Mikroskop weiter auf, um doch irgendwie noch unter ein Angström Trennschärfe zu kommen“, sagt Stark.

Wie Tänzer im Blitzlicht

Um die Abläufe der chemischen Reaktionen zu erfassen, nutzen die Forscher aus, dass beim blitzartigen Einfrieren die Proteine in jeweils unterschiedlichen Zuständen und Reaktionsschritten festgehalten werden – wie dicht gedrängte Tänzer in einer Disko im Blitzlicht. Wie aber kann aus Hunderten statischer Bilder ein Film werden? Je mehr sich zwei Molekülzustände ähneln, so die Annahme, desto näher sind sie sich auch im zeitlichen Ablauf. Aneinandergesetzt ergibt das den wahrscheinlichen Bewegungsverlauf.

Die Forscher testeten das Konzept an Ribosomen, den Proteinfabriken in den Zellen. In jeder Sekunde werden an diesen Molekülkomplexen rund 20 Proteine produziert. Mit ihrer frostigen Methode konnten die Göttinger bereits einen Kurzfilm erstellen, der diesen Fundamentalprozess für einige Millisekunden in Echtzeit sichtbar macht.

Wie wir unser Fett bekommen

Die Künste ihrer Kryo-Elektronenmikroskopie erprobten die Göttinger Forscher an Fettsäuren. „Sie entstehen im Inneren großer Proteine. Die gleichen einem Käfig und sehen aus wie ein großes leeres Ei“, erklärt der Max-Planck-Forscher Stark. Seit Langem ist bekannt, dass die Fettsäuren im Innern des Molekülkäfigs (der „Fettsäure-Synthase“) schrittweise an verschiedenen Punkten zusammengebaut werden. Das geschieht in sieben Einzelreaktionen, die sechs Mal hintereinander in derselben Reihenfolge durchlaufen werden. Jede der Einzelreaktionen hat am Fettsäure-Synthase-Molekül ein eigenes katalytisches Zentrum, zu dem es geschafft werden muss. „Das erledigt ein Transport-Protein, das die wachsende Fettsäurekette von einer Stelle zur anderen bringt, um dort das nächste Teilstück anzufügen“, erklärt Stark.

Mit der Kryo-Elektronenmikroskopie verfolgte das Göttinger Forscherteam jetzt im Detail, wie diese Einzelschritte ablaufen. „Wenn man weiß, wie die Reaktionsräume aufgebaut sind und wie die katalytisch aktiven Reste verbogen sind, dann kann man auch ein Molekül entwerfen, das da genau hineinpasst“, sagt Stark. Womöglich wird sich mit solchen Blockademolekülen künftig ein Teil der Fettproduktion im menschlichen Körper unterbinden lassen. Erleichternde Aussicht: Das könnte zu einem Medikament führen, das Übergewichtigen hilft, überflüssige Pfunde loszuwerden.